Regulação do ciclo de Krebs

O ciclo de Krebs tem um papel central no nosso metabolismo. Em todas as aulas de metabolismo que eu dou, o ciclo de Krebs está presente...
Tal como já referi em posts anteriores, é composto por 8 passos, sendo que 3 deles são catalisados por enzimas regulatórias. Essas enzimas são a citrato sintase (1ª reação), isocitrato desidrogenase (3ª reação) e alfa-cetoglutarato desidrogenase (4ª reação).
Neste post vou falar um pouco sobre os principais ativadores e inibidores de cada uma delas. Conforme vão poder ver, existem muitos moduladores que são comuns a mais do que uma enzima, o que facilita a vida de quem tem que estudar esta via metabólica. :)

Citrato sintase:

Inibidores
Succinil-CoA - é um intermediário do ciclo de Krebs. Mais concretamente, é o 4ª intermediário do ciclo de Krebs, ou seja, é formado numa reação posterior à reação que estamos a considerar. Sendo assim, se temos uma acumulação de intermediários formados em reações posteriores, faz todo o sentido que esses possam inibir as primeiras reações da via metabólica em causa, neste caso a primeira.
Citrato - é o produto da reação, pelo que faz sentido que iniba a sua síntese.
ATP - o ciclo de Krebs é uma via catabólica, ou seja, tem como objetivo produzir energia (ATP). Se a célula já tiver energia, o processo é inibido.
NADH - o raciocínio é equivalente ao feito para o ATP. Ou seja, o NADH tem um potencial energético elevado, pois na respiração celular pode levar à produção de ATP, pelo que é lógico que funcione como um inibidor do ciclo de Krebs.
Ácidos gordos-CoA de cadeia longa - não está completamente esclarecido o papel inibitório dos ácidos gordos de cadeia longa no ciclo de Krebs, mas pensa-se que essa propriedade está relacionada com o facto de funcionarem como detergentes, pois são compostos anfipáticos, compostos por uma parte polar (grupo carboxílico) e uma parte apolar (cadeia hidrocarbonada). O ácido oleico (18 carbonos e uma ligação dupla no carbono 9) aparenta ser o principal ácido gordo inibidor da citrato sintase.

Ativadores
ADP - o ADP sinaliza um défice energético na célula, pois é produzido quando se gasta ATP para obtenção de energia. Sendo assim, faz todo o sentido que ative o ciclo de Krebs, pois o objetivo principal desta via metabólica é a produção de energia.

Isocitrato desidrogenase:

Inibidores
Succinil-CoA - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
ATP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
NADH - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.

Ativadores
ADP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
Ca2+ (músculo) - conforme já referi num post anterior, sobre a regulação do complexo piruvato desidrogenase, o Ca2+ é um mensageiro intracelular cuja concentração aumenta durante a contração muscular. Portanto, nesse contexto de contração as células vão precisar de energia, pelo que os processos catabólicos, e, em particular, o ciclo de Krebs, será ativado.

Alfa-cetoglutarato desidrogenase:

Inibidores
Succinil-CoA - é o produto da reação, pelo que faz sentido que iniba a sua síntese.
ATP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
NADH - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.

Ativadores
Ca2+ (músculo) - o raciocínio que foi efetuado para a isocitrato desidrogenase aplica-se nesta situação.

Regulação da oxidação do piruvato (parte 2)

A atividade do complexo piruvato desidrogenase é regulada essencialmente através de 2 mecanismos distintos - alosteria e modificação covalente reversível.

De facto, existem alguns moduladores alostéricos deste complexo, que, neste caso concreto pertencem à classe dos moduladores negativos, ou seja, inibidores da atividade catalítica:

- acetil-CoA – sendo o produto da reação, faz todo o sentido que a molécula de acetil-CoA tenha um efeito inibitório sobre a sua própria síntese

- NADH – um dos produtos da reação é o NADH, portanto o raciocínio é equivalente ao efetuado em cima para a acetil-CoA. Além disso, e conforme já foi referido noutros posts aqui do blog, o NADH pode estar envolvido na síntese de ATP (através da respiração celular), pelo que a sua presença indica um potencial estado energético em alta dentro da célula. Nesse sentido, e como a oxidação do piruvato a acetil-CoA faz parte do catabolismo, cujo principal objetivo é a obtenção de energia, faz sentido que o NADH inibe o catabolismo e, em particular, esta reação.

Em relação à modificação covalente reversível, este complexo enzimático é inibido por fosforilação e ativado por desfosforilação. Este processo é mediado por 2 enzimas diferentes… A que fosforila designa-se por piruvato desidrogenase cinase, enquanto que a que desfosforila chama-se piruvato desidrogenase fosfatase.

Fatores que ativam a cinase, levando à fosforilação do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, inibidores da sua atividade catalítica):

- acetil-CoA e NADH – além do seu efeito direto no complexo piruvato desidrogenase, como inibidores alostéricos, estas duas moléculas ativam também a fosforilação do mesmo, promovendo a sua inibição, portanto, através de 2 mecanismos distintos

Fatores que inibem a cinase, favorecendo no equilíbrio a forma desfosforilada do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, ativadores da sua atividade catalítica):

- NAD⁺ – em relação a esta molécula pode fazer-se o raciocínio inverso ao efetuado para o NADH. Ou seja, a presença de NAD⁺ indica um défice energético da célula, pelo que será necessário ativar o catabolismo para contrariar esse défice.

- ADP – o raciocínio é equivalente ao anterior, pois dizer-se que a célula está a acumular ADP significa dizer que está a gastar ATP, ou seja, vai necessitar de produzir novamente ATP

- piruvato – o piruvato é o substrato da reação, sendo que a sua presença vai ativar o complexo piruvato desidrogenase através da inibição do processo de fosforilação (e, consequentemente, inibição) do complexo piruvato desidrogenase

- coenzima A (CoA) – este cofator tem um papel de co-substrato, pelo que a sua presença vai afetar a atividade catalítica do complexo de forma idêntica à descrita para o piruvato

Fatores que ativam a fosfatase, levando à desfosforilação do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, ativadores da sua atividade catalítica):

- Ca²⁺ – o ião cálcio é um modulador importantíssimo do nosso metabolismo. Neste caso em concreto, este ião atua (no músculo) ao nível da piruvato desidrogenase fosfatase, ativando-o, através da promoção da sua desfosforilação. De uma forma simples, o ião cálcio é um indicador da contração muscular, pelo que faz todo o sentido que num contexto de trabalho muscular o catabolismo esteja ativo, de forma a haver ATP disponível para esse processo

Regulação da oxidação do piruvato (parte 1)

O complexo piruvato desidrogenase é regulado principalmente através de dois mecanismos distintos: alosteria e modificação covalente reversível. Ambos podem atuar (e atuam, normalmente!) ao mesmo tempo, sendo que há moléculas (ativadores e inibidores) que intervêm nos dois processos simultaneamente.

Ativadores do complexo piruvato desidrogenase

- AMP e ADP – o AMP e o ADP são duas moléculas que são obtidas quando se utiliza o ATP como fonte de energia química (o ATP pode ser clivado a ADP ou a AMP). Portanto, ambas as moléculas sinalizam um estado energético baixo, pelo que faz todo o sentido que funcionem como ativadores dos processos que permitem obter energia, os processos catabólicos. Uma vez que a oxidação do piruvato faz parte do catabolismo, este processo é ativado pelo AMP e ADP.
- CoA – é um dos cofatores da enzima que aparece incorporado nos produtos (o piruvato é simultaneamente descarboxilado, oxidado e combinado com CoA). Ou seja, como se trata de uma molécula que vai reagir com o substrato, a sua presença ativa a enzima.
- NAD+ – tal como a molécula de CoA, o NAD+ é também utilizado na reação, parecendo nos produtos (sob a forma de NADH). Além disso, uma vez que o NADH pode ser utilizado para se sintetizar ATP (na respiração celular), onde é oxidado a NAD+, este último é um indicador de um estado energético baixo na célula. Por tudo isto, faz todo o sentido que esta molécula seja um ativador da oxidação do piruvato.
- Ca2+ (músculo) – o ião cálcio é um importante mediador de várias respostas celulares. Um dos processos onde intervém é na contração muscular. Portanto, sendo este ião um indicador da contração muscular, que é um processo que consome muito ATP, é vantajoso para as célula musculares poderem utilizá-lo simultaneamente como um ativador do catabolismo e, em particular, da oxidação do piruvato. Assim consegue-se que com o mesmo sinalizador o músculo entre em contração e ative o catabolismo.
- Piruvato – o piruvato é o substrato do complexo piruvato desidrogenase, portanto, faz todo o sentido que funcione como um ativador.
- Desfosforilação – na forma desfosforilada, o complexo piruvato desidrogenase é ativo.

Inibidores do complexo piruvato desidrogenase
- ATP – o principal objetivo do catabolismo é produzir energia, principalmente sob a forma de ATP. Se a célula já tiver ATP, ou NADH (que, conforme referi em cima, pode levar à produção de ATP), o catabolismo é inibido.
- Acetil-CoA – sendo o produto da reação, é lógico que tenha um papel inibitório no processo.
- Ácidos gordos de cadeia longa – alguns ácidos gordos, particularmente os de cadeia longa, funcionam como inibidores desta reação.
- Fosforilação – o complexo piruvato desidrogenase é inativado por fosforilação reversível.

Animação sobre a inibição por feedback

Aqui fica o link para o download de uma animação em flash sobre a inibição por feedback, também designada por feedback negativo ou retro-inibição.

http://www.mediafire.com/?du7e5ag5poj2c4o

Mapa metabólico sobre a regulação da tradução proteica

http://www.biocarta.com/genes/Metabolism.asp

Regulação da glicólise

A glicólise fornece à célula diferentes moléculas importantes para o seu correcto funcionamento. A principal é o ATP, o dador de energia química na maior parte dos nossos processos. No entanto, fornece também vários precursores para outros processos, tais como síntese de aminoácidos, por exemplo. Assim, torna-se fundamental haver uma regulação rigorosa da glicólise, de forma a que a célula possa responder a diferentes necessidades de ATP ou de outros metabolitos.

Durante os seus estudos acerca da fermentação da glucose por leveduras, Louis Pasteur descobriu que a taxa e a quantidade de glucose consumida era superior em condições anaeróbicas do que em condições aeróbicas! À primeira vista isto pode parecer estranho, pois normalmente associa-se o metabolismo aeróbico a algo mais vantajoso para a célula. De facto, a explicação bioquímica é simples: em condições anaeróbicas uma molécula de glucose gera duas moléculas de ATP, mas em condições aeróbicas gera 30 ou 32 moléculas de ATP. Simplificando o raciocínio, se pensarmos que em 5 minutos a levedura vai precisar de obter 30 ATP, isto significa que em condições aeróbicas só precisa de gastar uma molécula de glucose nesse intervalo de tempo, enquanto que em condições anaeróbicas, como o processo é menos rentável do ponto de vista energético, é necessário gastar 15 moléculas de glucose. Ou seja, o fluxo de glucose através da via glicolítica é regulado em função dos níveis de ATP da célula (bem como reservas adequadas de intermediários glicolíticos que desempenham papéis biosintéticos).

Conforme já referi em posts anteriores, a glicólise possui 10 reacções, sendo que 3 delas são pontos de regulação (reacções irreversíveis). As enzimas que as catalizam são a hexocinase (reacção 1), PFK-1 (reacção 3) e piruvato cinase (reacção 10). Como estas reacções são os passos limitantes da glicólise, alterações na velocidade de actuação das respectivas enzimas vão alterar a velocidade global da via glicolítica.

Das 3 enzimas regulatórias, a principal é a PFK-1. Isto pode parecer estranho, pois realmente o que era mais lógico era que a principal enzima regulatória fosse a primeira… Mais uma vez, existe uma explicação muito simples para tal não ocorrer. O que se passa é que a hexocinase é uma enzima comum também a outros processos metabólicos (síntese de glicogénio e via das pentoses fosfato). Por outras palavras, apesar de ser uma enzima regulatória, não é exclusiva da glicólise. Sendo assim, o principal ponto de regulação da glicólise terá que ser o segundo, ou seja, a reacção catalisada pela PFK-1.

Uma coisa que eu costumo dizer aos meus alunos é que nesta parte da regulação é preferível perceber porque é que determinadas moléculas activam e outras inibem a via metabólica, evitando assim decorar listas infindáveis de moduladores… Claro que nem sempre é possível fazer um raciocínio directo para perceber porque é que algumas moléculas funcionam como activadores e outras como inibidores, mas sempre que for possível eu vou desenvolver essa ideia… Vamos então passar a uma listagem dos principais moduladores da glicólise.

Activadores da hexocinase:

- Frutose-1-fosfato (fígado) – Compete com a frutose-6-fosfato para a proteína reguladora da glucocinase, cancelando o seu efeito inibitório.

-  Fosfato inorgânico (Pi) – É um interveniente no processo glicolítico (intervém na reacção 6) pelo que faz sentido que a ter um papel regulatório, seja um papel estimulador.

Inibidores da hexocinase:

- Glucose-6-fosfato (músculo) – Faz sentido que funcione como inibidor, pois é o produto da reacção. Se temos muito produto, não vamos precisar de continuar a produzir mais…

- Frutose-6-fosfato (fígado) – É o produto da reacção seguinte (reacção 2), mas pode ser interpretado da mesma forma que o anterior. Ou seja, se estamos a acumular o intermediário formado a partir do produto da reacção, não adianta continuarmos a sintetizar mais produto. Esta inibição ocorre através de uma proteína denominada proteína reguladora da glucocinase.

Activadores da PFK-1:

- Frutose-2,6-bisfosfato (fígado) – Regulador alostérico mais significativo da PFK-1, reduzindo a sua afinidade para os inibidores ATP e citrato. É produzida em resposta à insulina e degradada em resposta ao glucagon.

- Frutose-6-fosfato –É o substrato, portanto faz sentido que se temos muito substrato a enzima seja activada.

- ADP e AMP – São produzidos quando se gasta ATP, ou seja, sinalizam um estado energético em baixa. Sendo assim, faz todo o sentido que activem a glicólise, de forma a que a célula possa repor os seus valores energéticos normais. Activam a enzima porque aliviam a inibição causada pelo ATP.

Inibidores da PFK-1:

- Glucagon (fígado) – Esta hormona é produzida numa situação de hipoglicemia e tem como objectivo elevar a concentração de glucose no sangue. Portanto, faz todo o sentido que iniba a glicólise, pois este processo gasta glucose, o que vai acentuar ainda mais a reduzida concentração sanguínea de glucose. Conforme referido anteriormente, o glucagon diminui os níveis de frutose-2,6-bisfosfato.

- ATP – O principal objectivo da glicólise é produzir energia (ATP). Portanto, se a célula já tiver ATP, faz todo o sentido que a glicólise seja inibida, impedindo assim um gasto desnecessário de um combustível metabólico tão precioso como a glucose! O ATP inibe a PFK-1 porque diminui a afinidade da enzima para o seu substrato, a frutose-6-fosfato.

- Citrato – Acentua o efeito inibitório do ATP. Esta molécula é o primeiro intermediário do passo seguinte do catabolismo aeróbico, o ciclo de Krebs. Portanto, se se estão a acumular intermediários do ciclo de Krebs, não adianta continuar a efectuar glicólise.

- Fosfoenolpiruvato – É um intermediário da glicólise formado na penúltima reacção. Ora, se está a acumular-se este intermediário, as reacções anteriores têm que ser inibidas, de forma a impedir uma acumulação ainda maior dessa molécula.

- H⁺ – Esta enzima é particularmente sensível a alterações de pH, funcionando como um “interruptor” que se desliga, por exemplo, quando efectuamos uma fermentação láctica (produz H⁺) exagerada, impedindo uma acumulação de H⁺ ainda maior.

Activadores da piruvato cinase:

- ADP – O motivo é o mesmo que já foi referido para a PFK-1, ou seja, é um indicador de um défice energético, pelo que vai levar a uma activação da glicólise.

- Frutose 1,6-bisfosfato – É um intermediário da glicólise formado numa reacção anterior à catalisada pela piruvato cinase. Sendo assim, se se estão a acumular intermediários numa fase anterior, temos que activar esta enzima, de forma a contrariar essa acumulação (é como quando uma barragem acumula muita água, e para repor os valores normais é necessário abrir a comporta…).

- Desfosforilação (fígado) – Induzida, por exemplo, pela insulina, o que faz todo o sentido, tendo em conta que a insulina é produzida numa situação de excesso de açúcar no sangue (hiperglicemia) e vai activar os processos (um deles é a glicólise!) que consumam glucose, de forma a baixar a concentração sanguínea de glucose.

Inibidores da piruvato cinase:

- ATP – É um transportador de energia química e um dos produtos finais da glicólise, logo, se existir já não é preciso efectuar a degradação da glucose. Diminui a afinidade da enzima para o fosfoenolpiruvato.

- Acetil-coA – É a molécula na qual o produto desta reacção (piruvato) é convertido, no caso do catabolismo aeróbico. Portanto, se se acumula acetil-CoA, não fazia sentido continuar a sintetizar piruvato, pelo que a enzima é inibida.

- Ácidos gordos de cadeia longa.

- Fosforilação (fígado) – Induzida, por exemplo, por acção do glucagon, que, conforme referi anteriormente, vai ter como principal função elevar os níveis de glucose no sangue. Para tal, inibe, por exemplo, a glicólise.

- NADH – Conforme iremos ver mais em detalhe quando eu falar da respiração celular, o NADH tem potencial para originar moléculas de ATP, pelo que sinaliza um estado energético em alta da célula. Nessa situação, não é preciso recorrer à glicólise para obter mais energia.

- Alanina – Este aminoácido (um dos 20 aminoácidos standard) pode originar piruvato (produto da reacção da piruvato cinase!) por remoção do seu grupo amina. Portanto, se existe uma molécula que pode originar directamente piruvato, não precisamos de estar a gastar glucose para o produzir.

Resumindo, é possível fazer algumas generalizações acerca da regulação das vias metabólicas, que irão ser úteis para perceber a regulação dos restantes processos.

Primeiro, moléculas energéticas, tais como o ATP, ou potencialmente energéticas, tais como o NADH são, de uma maneira geral, inibidores do catabolismo. Isto é muito fácil de perceber se pensarmos que o principal objectivo do catabolismo é produzir energia. Se a célula já tiver essa energia, não precisa de degradar mais nutrientes para produzir energia! O raciocínio oposto aplica-se ao ADP, AMP e NAD⁺, pois qualquer uma destas moléculas sinaliza um défice energético na célula (lembrem-se que quando gastamos ATP obtemos ADP ou AMP, e quando gastamos NADH obtemos NAD⁺…), pelo que será necessário repor os níveis energéticos, e para tal activa-se o catabolismo.

Segundo, o produto da reacção, ou intermediários formados a partir deste (produtos de reacções seguintes à reacção a considerar) são inibidores. Por outro lado, o substrato, ou intermediários que irão originar o substrato (formados em reacções anteriores à reacção que se está a considerar), são activadores.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Regulação do metabolismo

O nosso organismo apresenta uma flexibilidade metabólica notável! Basta pensar, por exemplo, que nós conseguimos adaptarmo-nos a situações tão contrárias como: estar 8-9 horas sem comer (quando dormimos, por exemplo), ou ingerir uma refeição muito calórica.

  

 

Ou então fazer um exercício físico muito intenso e num curto espaço de tempo, ou um exercício mais moderado e mais demorado, ou ainda ficar em repouso. Esta nossa capacidade de lidar correctamente com estes opostos é uma consequência da regulação que as nossas vias metabólicas sofrem.

 

 A regulação dos processos metabólicos é, na minha opinião o aspecto central para uma compreensão correcta do metabolismo.

Antes de começar a falar em concreto da regulação de cada via metabólica, convém abordar alguns conceitos mais gerais…

Em primeiro lugar, o que é a regulação das vias metabólicas? É o processo pelo qual a velocidade global de cada processo é alterada. Atenção, quando se fala em regulação não se está obrigatoriamente a falar de inibição, pois as vias metabólicas podem ser activadas ou inibidas.

Todas as vias metabólicas apresentam pelo menos uma reacção específica desse processo, que é irreversível. Isto garante à célula 2 aspectos muito importantes:

1. Faz com que as vias metabólicas não ocorram nos dois sentidos, como consequência apenas do fluxo de massas. Ou seja, se uma via metabólica produzir a molécula X e a célula precisar de produzir mais X, não vai ser pelo facto de já existir essa molécula dentro da célula que se vai dar a degradação da mesma.

2. Permite regular especificamente uma via metabólica sem ter que afectar outros processos, nomeadamente, o processo oposto. Para perceber isto podemos pensar em dois processos opostos, na glicólise (degradação de glucose) e na gluconeogénese (síntese de glucose), por exemplo. Nas células os dois processos não ocorrem simultaneamente, pois não fazia sentido estar a degradar e sintetizar glucose ao mesmo tempo. Portanto, quando um está activo, ou outro tem que estar inibido. Se ambos fossem catalisados pelas mesmas enzimas, era impossível activar um processo e inibir o outro. Ou se activavam os dois, ou se inibiam os dois… Como é que conseguimos dar a volta a este problema? Recorrendo pelo menos a uma enzima específica para cada processo! Assim, se eu tiver uma enzima específica na glicólise (na realidade são 3…) que não actua na gluconeogénese, eu posso activar ou inibir este processo sem afectar o oposto. J

São exactamente estas reacções específicas e irreversíveis que são catalisadas pelas chamadas enzimas regulatórias. As enzimas regulatórias são enzimas que funcionam como uma espécie de válvulas das vias metabólicas onde estão inseridas, permitindo “escoar” mais intermediários, se fizer falta mais produto, ou acumular esses intermediários, se existir produto suficiente. As reacções catalisadas por estas enzimas são muitas vezes designadas por pontos de regulação, sendo consideradas os passos limitantes (mais lentos) do processo do qual fazem parte. Sendo assim, se a sua velocidade for aumentada, a velocidade global da via onde estão inseridas aumenta, e se a sua velocidade for diminuída, a velocidade global do processo também diminui.

Há 4 tipos de regulação das vias metabólicas:

1. Disponibilidade do substrato – É o método de regulação mais rápido e afecta todas as enzimas de cada via metabólica. Basicamente, se existir pouco substrato, as enzimas não vão poder actuar à sua velocidade máxima, e se não existir substrato, as enzimas param.

2. Regulação alostérica – É a forma mais rápida de regulação específica de apenas determinadas enzimas, as chamadas enzimas regulatórias. Esta forma de regulação requer a presença de moléculas (moduladores alostéricos) que vão interactuar com as enzimas, levando a alterações estruturais que podem tornar a enzima mais rápida ou mais lenta (moduladores positivos e negativos, respectivamente).
3. Regulação hormonal – É um processo mais demorado do que a regulação alostérica, e envolve a produção de hormonas em resposta a um estímulo. As hormonas são lançadas na corrente sanguínea e vão actuar nas células-alvo. Normalmente a sua acção culmina na fosforilação ou desfosforilação das enzimas regulatórias, alterando a sua eficiência catalítica (activa ou inibe, dependendo da enzima em causa). Este efeito designa-se por modificação covalente reversível.
4. Alterações na concentração das enzimas – Esta é a forma mais lenta de regulação e pressupõe alterações nas taxas de síntese e degradação das enzimas, alterando a sua concentração. Por exemplo, se a célula pretender activar uma via metabólica, pode fazê-lo aumentando a quantidade das enzimas dessa via. Desde que o substrato não seja limitante, a velocidade global da conversão de substrato em produto vai aumentar. O efeito contrário verifica-se fazendo o raciocínio inverso.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers