Fosfofrutocinase 1

A fosfofrutocinase 1, também conhecida como PFK-1, é a segunda enzima regulatória da glicólise e o seu principal ponto de regulação. É uma enzima alostérica pertencente à família das fosfotransferases que catalisa uma fosforilação: a conversão de frutose-6-fosfato e ATP em frutose-1,6-bisfosfato e ADP, um passo chave na regulação e limitação da taxa de glicólise, em resposta às necessidades energéticas da célula, através do processo de inibição alostérica.A regulação alostérica é a forma mais rápida de regulação específica de determinadas enzimas – as enzimas regulatórias. Requer a presença de moléculas, os moduladores alostéricos, que interatuam com as enzimas, conduzindo a alterações estruturais, tornando a enzima ou mais rápida (moduladores positivos) ou mais lenta (moduladores negativos).

A nível estrutural, apresenta-se como um homotetrâmero, ou seja, é constituída por 4 subunidades. A PFK-1 pode ser composta por três tipos de formas: M, L ou P, dependendo do tipo de tecido em que se encontra. Por exemplo, o músculo expressa apenas a isoenzima M. Já no fígado e rins predomina a isoforma L. Quanto aos eritrócitos expressam ambas as formas M e L.
Cada subunidade deste tetrâmero possui 319 aminoácidos e é composto por dois domínios: um que se liga ao ATP e o outro que se liga à frutose-6-fosfato.
O domínio N-terminal possui um papel de catalisador de ligação de ATP, enquanto que o terminal C apresenta um papel regulador.
A atividade da PFK-1 depende de um mecanismo em que ocorre transição de um estado T enzimaticamente inativo para um estado R ativo. Se, por um lado, a frutose-6-fosfato se liga, com elevada afinidade, ao estado R, já a mudança para o estado T inibe a sua capacidade de se ligar à enzima.
A atividade desta enzima é controlada por ativadores e inibidores. Por um lado, os ativadores podem ser indicadores de défice energético (ADP, AMP), já que a glicólise pretende compensar esse défice; ou o substrato da reação que catalisa (frutose-6-fosfato), entre outros ativadores. Por outro lado, como inibidores existem o ATP, visto que, se a célula já possuir ATP suficiente, faz todo o sentido que a glicólise seja inibida; o produto da reação (frutose-1,6-bisfosfato), assim como todos os intermediários gerados nas reações seguintes; os intermediários do ciclo de Krebs, se houver acumulação destes intermediários, não será necessário continuar o processo de glicólise; o glucagon, dado que, esta hormona é produzida em situações de hipoglicemia e tem como objetivo elevar a concentração de glucose no sangue, não fazendo sentido gastá-la; entre outros inibidores.
Os ativadores alostéricos ligam-se com o objectivo de facilitar a formação do estado R, induzindo alterações estruturais na enzima, já os inibidores ligam-se para facilitar a formação do estado T inibindo, assim, a atividade da enzima.

Texto escrito por:
Ana Maria Araújo
Ana Sofia Oliveira
Maria Sofia Silva
Renata Teixeira
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Enolase

A enolase é uma enzima, mais concretamente uma metaloenzima ativada. Esta enzima pertence à família das liases, as hidro-liases, que quebram as ligações carbono-oxigénio e está presente em todos os tecidos e organismos que realizam a glicólise ou a fermentação. O pH ótimo é de 6,5 para a atividade desta enzima no ser humano. A sua principal função é a intervenção no 9º passo da glicólise (penúltimo passo desta via metabólica), etapa em que ocorre a desidratação de 2-fosfoglicerato (2-PG) em fosfoenolpiruvato (PEP), produto que irá ser usado, no próximo e último passo, para a produção de energia (ATP). 

A enolase possui 3 isoformas diferentes: a ENO1 ou alfa-enolase (no tecido muscular); ENO2 ou gama-enolase ou enolase neuro específica (nos neurónios); ENO3 ou beta-enolase (nas células do músculo esquelético). A enolase tem um peso molecular de cerca de 100000 Daltons (dependendo da sua isoforma). Num humano, a α-enolase tem duas subunidades antiparalelas, que têm dois domínios diferentes que apresentam interações hidrofóbicas. As subunidades interatuam através de pontes salinas, que envolvem arginina e glutamato. A enolase específica para os neurónios é libertada numa enorme variedade de doenças neurológicas, tais como esclerose múltipla ou AVC, ou em enfartes do miocárdio. Em diversas experiências médicas, têm se empregado concentrações de enolase em amostras na tentativa de diagnosticar certas condições e a sua gravidade. Diversos estudos demonstraram que diferentes níveis de enolase estão relacionados com o crescimento tumoral ou com a ocorrência de enfarte do miocárdio ou um AVC, pelo que foi inferido que os níveis de enolase servem de indicativos na avaliação prognóstica de vítimas de paragem cardíaca. Inibidores da enolase têm sido aproveitados na área da saúde para tratamento e prevenção de várias doenças, destacando-se a fosfonoacetohidroxamato, que tem sido utilizado como

fármaco anti-tripanossoma e mais recentemente, como agente anti-cancerígeno.
A enolase pode ser inibido pelo ião fluoreto (F-). O fluoreto forma um complexo com magnésio e fosfato, que se liga ao centro ativo da enzima em vez do substrato 2-PG, impedindo a conversão de 2-PG a PEP, havendo menor produção de PEP e, consequentemente, ATP. A ingestão de água com flúor, inibe assim a atividade catalítica da enolase das bactérias da cavidade bucal (local altamente anaeróbico e dependente da glicólise), interrompendo a via glicolítica destas (redução do metabolismo de carbohidratos) e, consequentemente, a fermentação bateriana (diminuição de produção de ácidos), prevenindo a formação de cáries dentárias.

Texto escrito por:

Inês Carvalho
Junjie Lin
Maria Alves
Susana Pinto.

Regulação da oxidação do piruvato (parte 2)

A atividade do complexo piruvato desidrogenase é regulada essencialmente através de 2 mecanismos distintos - alosteria e modificação covalente reversível.

De facto, existem alguns moduladores alostéricos deste complexo, que, neste caso concreto pertencem à classe dos moduladores negativos, ou seja, inibidores da atividade catalítica:

- acetil-CoA – sendo o produto da reação, faz todo o sentido que a molécula de acetil-CoA tenha um efeito inibitório sobre a sua própria síntese

- NADH – um dos produtos da reação é o NADH, portanto o raciocínio é equivalente ao efetuado em cima para a acetil-CoA. Além disso, e conforme já foi referido noutros posts aqui do blog, o NADH pode estar envolvido na síntese de ATP (através da respiração celular), pelo que a sua presença indica um potencial estado energético em alta dentro da célula. Nesse sentido, e como a oxidação do piruvato a acetil-CoA faz parte do catabolismo, cujo principal objetivo é a obtenção de energia, faz sentido que o NADH inibe o catabolismo e, em particular, esta reação.

Em relação à modificação covalente reversível, este complexo enzimático é inibido por fosforilação e ativado por desfosforilação. Este processo é mediado por 2 enzimas diferentes… A que fosforila designa-se por piruvato desidrogenase cinase, enquanto que a que desfosforila chama-se piruvato desidrogenase fosfatase.

Fatores que ativam a cinase, levando à fosforilação do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, inibidores da sua atividade catalítica):

- acetil-CoA e NADH – além do seu efeito direto no complexo piruvato desidrogenase, como inibidores alostéricos, estas duas moléculas ativam também a fosforilação do mesmo, promovendo a sua inibição, portanto, através de 2 mecanismos distintos

Fatores que inibem a cinase, favorecendo no equilíbrio a forma desfosforilada do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, ativadores da sua atividade catalítica):

- NAD⁺ – em relação a esta molécula pode fazer-se o raciocínio inverso ao efetuado para o NADH. Ou seja, a presença de NAD⁺ indica um défice energético da célula, pelo que será necessário ativar o catabolismo para contrariar esse défice.

- ADP – o raciocínio é equivalente ao anterior, pois dizer-se que a célula está a acumular ADP significa dizer que está a gastar ATP, ou seja, vai necessitar de produzir novamente ATP

- piruvato – o piruvato é o substrato da reação, sendo que a sua presença vai ativar o complexo piruvato desidrogenase através da inibição do processo de fosforilação (e, consequentemente, inibição) do complexo piruvato desidrogenase

- coenzima A (CoA) – este cofator tem um papel de co-substrato, pelo que a sua presença vai afetar a atividade catalítica do complexo de forma idêntica à descrita para o piruvato

Fatores que ativam a fosfatase, levando à desfosforilação do complexo piruvato desidrogenase (ou seja, ativadores da sua atividade catalítica):

- Ca²⁺ – o ião cálcio é um modulador importantíssimo do nosso metabolismo. Neste caso em concreto, este ião atua (no músculo) ao nível da piruvato desidrogenase fosfatase, ativando-o, através da promoção da sua desfosforilação. De uma forma simples, o ião cálcio é um indicador da contração muscular, pelo que faz todo o sentido que num contexto de trabalho muscular o catabolismo esteja ativo, de forma a haver ATP disponível para esse processo

Regulação da oxidação do piruvato (parte 1)

O complexo piruvato desidrogenase é regulado principalmente através de dois mecanismos distintos: alosteria e modificação covalente reversível. Ambos podem atuar (e atuam, normalmente!) ao mesmo tempo, sendo que há moléculas (ativadores e inibidores) que intervêm nos dois processos simultaneamente.

Ativadores do complexo piruvato desidrogenase

- AMP e ADP – o AMP e o ADP são duas moléculas que são obtidas quando se utiliza o ATP como fonte de energia química (o ATP pode ser clivado a ADP ou a AMP). Portanto, ambas as moléculas sinalizam um estado energético baixo, pelo que faz todo o sentido que funcionem como ativadores dos processos que permitem obter energia, os processos catabólicos. Uma vez que a oxidação do piruvato faz parte do catabolismo, este processo é ativado pelo AMP e ADP.
- CoA – é um dos cofatores da enzima que aparece incorporado nos produtos (o piruvato é simultaneamente descarboxilado, oxidado e combinado com CoA). Ou seja, como se trata de uma molécula que vai reagir com o substrato, a sua presença ativa a enzima.
- NAD+ – tal como a molécula de CoA, o NAD+ é também utilizado na reação, parecendo nos produtos (sob a forma de NADH). Além disso, uma vez que o NADH pode ser utilizado para se sintetizar ATP (na respiração celular), onde é oxidado a NAD+, este último é um indicador de um estado energético baixo na célula. Por tudo isto, faz todo o sentido que esta molécula seja um ativador da oxidação do piruvato.
- Ca2+ (músculo) – o ião cálcio é um importante mediador de várias respostas celulares. Um dos processos onde intervém é na contração muscular. Portanto, sendo este ião um indicador da contração muscular, que é um processo que consome muito ATP, é vantajoso para as célula musculares poderem utilizá-lo simultaneamente como um ativador do catabolismo e, em particular, da oxidação do piruvato. Assim consegue-se que com o mesmo sinalizador o músculo entre em contração e ative o catabolismo.
- Piruvato – o piruvato é o substrato do complexo piruvato desidrogenase, portanto, faz todo o sentido que funcione como um ativador.
- Desfosforilação – na forma desfosforilada, o complexo piruvato desidrogenase é ativo.

Inibidores do complexo piruvato desidrogenase
- ATP – o principal objetivo do catabolismo é produzir energia, principalmente sob a forma de ATP. Se a célula já tiver ATP, ou NADH (que, conforme referi em cima, pode levar à produção de ATP), o catabolismo é inibido.
- Acetil-CoA – sendo o produto da reação, é lógico que tenha um papel inibitório no processo.
- Ácidos gordos de cadeia longa – alguns ácidos gordos, particularmente os de cadeia longa, funcionam como inibidores desta reação.
- Fosforilação – o complexo piruvato desidrogenase é inativado por fosforilação reversível.

Oxidação do piruvato

Em condições aeróbicas, a maioria das células eucarióticas e várias bactérias oxidam o piruvato, produzido na glicólise, a CO₂ e H₂O, em vez de o reduzirem a lactato ou etanol.

Produção de acetil-CoA a partir do piruvato

As moléculas de acetil-CoA são a forma sob a qual o ciclo de Krebs aceita a maior parte do seu combustível. O piruvato é oxidado a acetil-CoA e CO₂ por um complexo enzimático (3 enzimas) denominado complexo piruvato desidrogenase. Este complexo localiza-se na mitocôndria (eucariotas) ou no citosol (procariotas).

A oxidação do piruvato a acetil-CoA é um exemplo de uma descarboxilação oxidativa irreversível. A irreversibilidade da reacção foi demonstrada provando que quando se usa CO₂ marcado radioactivamente não é possível obter piruvato com carbono radioactivo.

Além da acetil-CoA e do CO2, esta reacção produz uma molécula de NADH a partir de NAD+.

O complexo piruvato desidrogenase requer a acção de 5 cofactores: tiamina pirofosfato (TPP), dinucleótido flavina adenina (FAD), coenzima A (CoA), dinucleótido nicotinamida adenina (NAD⁺) e lipoato. 4 vitaminas necessárias na nutrição humana são componente vitais deste sistema: tiamina (para TPP), riboflavina (para FAD), niacina (para NAD) e pantotenato (para CoA).

As enzimas componentes do complexo piruvato desidrogenase são: piruvato desidrogenase, dihidrolipoil transacetilase e dihidrolipoil desidrogenase. Cada uma destas enzimas está presente em múltiplas cópias.

Mutações nos genes que codificam as subunidades deste complexo enzimático, bem como uma dieta deficiente em tiamina podem ter consequências graves. Animais carentes de tiamina são incapazes de oxidar normalmente o piruvato. Isto tem implicações principalmente a nível do cérebro, que normalmente obtém toda a sua energia a partir da oxidação da glucose, num processo que envolve necessariamente a oxidação do piruvato. Beribéri é uma avitaminose causada por carência de tiamina é caracterizada por uma perda da função neuronal. Esta doença é mais frequente nas populações que se alimentam predominantemente de arroz branco (polido). É nas cascas do arroz que a maior parte da sua tiamina se encontra.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Fermentação alcoólica

A primeira reacção requer a presença de Mg²⁺ e a segunda reacção regenera NAD⁺ a partir de NADH (uma molécula por molécula de piruvato). Conforme já referi no post da fermentação láctica, é este o objectivo da fermentação, a regeneração de NAD⁺, para que a glicólise possa continuar a ocorrer.

A enzima piruvato descarboxilase está normalmente presente nas leveduras usadas no fabrico de bebidas e pão. A gaseificação do champanhe e de outras bebidas alcoólicas, bem como as bolhas presentes no miolo do pão são originadas pela descarboxilação do piruvato.

 

A fermentação alcoólica não ocorre no nosso organismo. Tenham em atenção que quando eu digo isto, não estou a afirmar que nós não conseguimos metabolizar o etanol, pois esse é um processo independente da fermentação. O que eu estou a dizer é que é impossível o nosso organismo converter glucose em etanol.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Fermentação láctica

Esta reacção é claramente favorecida no sentido directo. Em situações de hipoxia (esforço muscular intenso, por exemplo), ou ausência de mitocôndrias, a célula não é capaz de regenerar o NAD⁺ a partir de NADH através da cadeia respiratória. Por isso utiliza a conversão de piruvato em lactato, que consome NADH e liberta NAD⁺. Convém salientar que o NAD⁺ é indispensável para que a glicólise continue a ocorrer, permitindo assim a obtenção de energia através do catabolismo dos açúcares. Cada molécula de piruvato convertida em lactato regenera uma molécula de NAD⁺.

O lactato formado é enviado através da circulação sanguínea para o fígado, onde é convertido em glucose na gluconeogénese. A questão que se coloca é: “Então se é possível reciclar o lactato, convertendo-o novamente em glucose, porque é que é o fígado a fazer isso e não o músculo, uma vez que é no músculo que se produz o lactato? Assim o músculo podia aproveitar o seu produto da fermentação para repor os níveis de combustível metabólico!”. Se facto, à primeira vista até pode fazer sentido pensarmos assim. No entanto, a síntese de glucose, através da gluconeogénese, é um processo muito dispendioso, do ponto de vista energético, pelo que após um esforço físico intenso, não fazia sentido o músculo ter que gastar energia para sintetizar glucose. Sendo assim, a recuperação de um esforço intenso engloba não só a reposição dos níveis de ATP no músculo mas também um consumo extra de oxigénio no fígado, necessário para a síntese de ATP que será utilizado na gluconeogénese a partir do lactato. Por outras palavras, depois do esforço muscular, é o fígado que vai ter o trabalho de utilizar o lactato, permitindo uma recuperação muscular mais rápida e eficiente. Este processo designa-se por ciclo de Cori.

Durante o trabalho anaeróbico a concentração de lactato nas fibras musculares pode aumentar cerca de 30 vezes e é comum afirmar-se que é esta acumulação do ião lactato que provoca a fadiga. Contudo as evidências experimentais demonstram que embora a concentração de lactato esteja directamente relacionada com o grau de fadiga o ião lactato não interfere na actividade contráctil do músculo. A fadiga, as dores musculares e as cãimbras sentidas após um esforço físico intenso são o resultado da acidificação provocada pelo ácido láctico no músculo (o pH pode baixar de cerca de 7 para 6,5!!!). O pKa do ácido láctico é de cerca de 4, o que faz com que o pH das células (≈ 7) ou do plasma (≈ 7,4) provoque a dissociação do ácido láctico em lactato + H⁺. Esta acumulação de H⁺ vai interferir com a capacidade contráctil das fibras musculares e vai também invadir a fenda sináptica. Sendo assim, a incapacidade da junção neuromuscular em retransmitir os impulsos nervosos para as fibras musculares é devida, provavelmente, a uma menor liberação do transmissor químico acetilcolina por parte das terminações nervosas, devido à acidificação do líquido intersticial e alteração das estruturas proteicas (receptores de acetilcolina) pela acção dos H⁺.

Este sistema proporciona energia para actividades físicas que resultem em fadiga após cerca de 60-120 segundos. É portanto o principal processo metabólico associado a actividades como por exemplo corridas de até 400-800 m, provas de natação de 100-200 m, proporcionando também energia para momentos de alta intensidade no futebol, basquetebol, voleibol, ténis, entre outros. O denominador comum dessas actividades é a sustentação de esforço de alta intensidade com duração de 1-2 minutos. Mesmo os atletas melhor treinados são incapazes de sprintar por mais do que cerca de um minuto. Um atleta de alta competição necessita de cerca de 30 minutos para recuperar de uma corrida de 100m.

Alguns lactobacilos e estreptococus fermentam a lactose a ácido láctico no leite. A ionização do ácido láctico faz baixar o pH desnaturando a caseína (principal proteína do leite) e outras proteínas do leite. Quando essa desnaturação é controlada, e nas condições certas, obtem-se o iogurte ou o queijo.

Resumindo, a fermentação não serve para obter energia em condições anaeróbicas (esta ideia errada é muito comum…). Serve para regenerar o NAD⁺, de forma que a glicólise possa continuar a ocorrer na ausência de O₂, pois é a glicólise que vai produzir ATP!

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Destinos do piruvato

O destino do piruvato depende do tipo celular e das circunstâncias metabólicas. Há 3 destinos principais para o piruvato:

(1) Organismos e tecidos aeróbicos, em condições aeróbicas – o piruvato é oxidado, com perda do grupo carboxílico, originando o grupo acetil da acetil-CoA, que depois é oxidada a CO₂ durante o ciclo de Krebs;

(2) Tecidos aeróbicos em condições de pouco oxigénio (hipoxia muscular, por exemplo), alguns tecidos em condições aeróbicas (eritrócitos, por exemplo, porque não possuem mitocôndrias), ou alguns organismos anaeróbicos – o piruvato é reduzido a lactato através da fermentação láctica. Em condições de hipoxia muscular, o NADH não é reoxidado a NAD⁺, e o NAD⁺ é necessário para a glicólise. A redução do piruvato a lactato permite usar NADH como dador de electrões regenerando o NAD⁺;

(3) Alguns tecidos de plantas, alguns invertebrados, protistas e microorganismos, em condições anaeróbicas ou de hipoxia – o piruvato é convertido em etanol + CO₂ (fermentação alcoólica).

Apesar da glicólise poder ocorrer em condições anaeróbicas, tal facto tem um preço, pois reduz a quantidade de ATP formado por molécula de glucose (passa de 30 ou 32 ATP para apenas 2!), sendo, portanto necessário oxidar mais glucose nestas condições.

O que vai acontecer ao piruvato está directamente relacionado com a quantidade de NAD⁺ e FAD da célula. Como essas quantidades são muito pequenas, é necessário haver mecanismos para transformar o NADH+H⁺ e FADH₂ de novo em NAD⁺ e o FAD, respectivamente. Isto é feito por transferência dos electrões do NADH+H⁺ e FADH₂ para outras moléculas, o que pode ocorrer por fermentação ou respiração. A distinção entre estes não é (ao contrário do que geralmente se pensa) o facto de um processo utilizar directamente o O₂ e o outro não! O O₂ é apenas necessário para a fosforilação oxidativa, e não para a oxidação do piruvato. Ao contrário dos metabolismos aeróbios que dependem do aporte de oxigénio e são limitados pela disponibilidade deste, a glicólise anaeróbia não depende da disponibilidade de oxigénio e pode aumentar de velocidade até cerca de 1000 vezes a velocidade em repouso, ou seja, os 2 ATP/glucose podem representar muitos ATP/minuto.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Entrada de diferentes monossacarídeos na glicólise

Não é novidade nenhuma que a glicólise serve para degradar glucose, o monossacarídeo mais abundante da nossa dieta. Mas o que é que acontece com outros monossacarídeos que ingerimos? Será que podemos degradá-los para obter energia? Se sim, será que podemos recorrer à glicólise para isso?

A resposta a ambas as perguntas é sim. De facto, a glicólise permite degradar não só glucose mas também outros monossacarídeos, tais como a frutose, galactose e manose. Para isso, estes monossacarídeos têm que ser convertidos em intermediários glicolíticos.

Frutose

A frutose é obtida a partir da dieta em alimentos como as frutos, o mel ou os cereais, por exemplo.

 

Nos tecidos extra-hepáticos, que não possuem a glucocinase, a frutose é convertida em frutose-6-fosfato pela hexocinase, a primeira enzima da glicólise. Convém salientar que a hexocinase utiliza como substrato preferencial a glucose, mas pode também fosforilar outros monossacarídeos, como a frutose, por exemplo. Uma vez que a frutose-6-fosfato é um intermediário da glicólise, já pode depois seguir normalmente a via glicolítica.

Alternativamente, no fígado a frutose tem que sofrer um processo diferente, pois a glucocinase é muito específica para a glucose, não conseguindo, portanto, fosforilar a frutose. Neste caso, a frutose é fosforilada pela frutocinase, originando frutose-1-fosfato. Seguidamente, a aldolase, que é a 4ª enzima da glicólise, actua sobre a frutose-1-fosfato, clivando-a a dihidroxiacetona fosfato e gliceraldeído. A primeira molécula já é um intermediário da glicólise, pelo que pode serguir esse processo, mas a segunda não. Portanto, o gliceraldeído é posteriormente fosforilado pela gliceraldeído cinase, originando gliceraldeído-3-fosfato, que também é um intermediário glicolítico.

Galactose

A galactose é encontrada essencialmente em produtos lácteos, pois é um dos componentes da lactose.

 

A galactose é primeiramente fosforilada a galactose-1-fosfato pela galactocinase. Seguidamente a galactose-1-fosfato vai receber uma molécula de UDP, originando UDP-galactose. Esta reacção é catalisada pela galactose-1-fosfato uridil transferase. A UDP-galactose é depois epimerizada a UDP-glucose, por acção da UDP-galactose-4-epimerase. A UDP-glucose sofre uma troca da porção UDP por um grupo fosforilo, originando glucose-1-fosfato, que é depois convertida em glucose-6-fosfato (intermediário glicolítico) por acção da fosfoglucomutase (esta enzima participa também no metabolismo do glicogénio...).

Manose

A manose pode ser encontrada, por exemplo, em leguminosas.

 

A manose é fosforilada pela hexocinase e origina manose-6-fosfato. A manose-6-fosfato é convertida em frutose-6-fosfato (um intermediário glicolítico) pela fosfomanose isomerase.



Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Regulação da glicólise

A glicólise fornece à célula diferentes moléculas importantes para o seu correcto funcionamento. A principal é o ATP, o dador de energia química na maior parte dos nossos processos. No entanto, fornece também vários precursores para outros processos, tais como síntese de aminoácidos, por exemplo. Assim, torna-se fundamental haver uma regulação rigorosa da glicólise, de forma a que a célula possa responder a diferentes necessidades de ATP ou de outros metabolitos.

Durante os seus estudos acerca da fermentação da glucose por leveduras, Louis Pasteur descobriu que a taxa e a quantidade de glucose consumida era superior em condições anaeróbicas do que em condições aeróbicas! À primeira vista isto pode parecer estranho, pois normalmente associa-se o metabolismo aeróbico a algo mais vantajoso para a célula. De facto, a explicação bioquímica é simples: em condições anaeróbicas uma molécula de glucose gera duas moléculas de ATP, mas em condições aeróbicas gera 30 ou 32 moléculas de ATP. Simplificando o raciocínio, se pensarmos que em 5 minutos a levedura vai precisar de obter 30 ATP, isto significa que em condições aeróbicas só precisa de gastar uma molécula de glucose nesse intervalo de tempo, enquanto que em condições anaeróbicas, como o processo é menos rentável do ponto de vista energético, é necessário gastar 15 moléculas de glucose. Ou seja, o fluxo de glucose através da via glicolítica é regulado em função dos níveis de ATP da célula (bem como reservas adequadas de intermediários glicolíticos que desempenham papéis biosintéticos).

Conforme já referi em posts anteriores, a glicólise possui 10 reacções, sendo que 3 delas são pontos de regulação (reacções irreversíveis). As enzimas que as catalizam são a hexocinase (reacção 1), PFK-1 (reacção 3) e piruvato cinase (reacção 10). Como estas reacções são os passos limitantes da glicólise, alterações na velocidade de actuação das respectivas enzimas vão alterar a velocidade global da via glicolítica.

Das 3 enzimas regulatórias, a principal é a PFK-1. Isto pode parecer estranho, pois realmente o que era mais lógico era que a principal enzima regulatória fosse a primeira… Mais uma vez, existe uma explicação muito simples para tal não ocorrer. O que se passa é que a hexocinase é uma enzima comum também a outros processos metabólicos (síntese de glicogénio e via das pentoses fosfato). Por outras palavras, apesar de ser uma enzima regulatória, não é exclusiva da glicólise. Sendo assim, o principal ponto de regulação da glicólise terá que ser o segundo, ou seja, a reacção catalisada pela PFK-1.

Uma coisa que eu costumo dizer aos meus alunos é que nesta parte da regulação é preferível perceber porque é que determinadas moléculas activam e outras inibem a via metabólica, evitando assim decorar listas infindáveis de moduladores… Claro que nem sempre é possível fazer um raciocínio directo para perceber porque é que algumas moléculas funcionam como activadores e outras como inibidores, mas sempre que for possível eu vou desenvolver essa ideia… Vamos então passar a uma listagem dos principais moduladores da glicólise.

Activadores da hexocinase:

- Frutose-1-fosfato (fígado) – Compete com a frutose-6-fosfato para a proteína reguladora da glucocinase, cancelando o seu efeito inibitório.

-  Fosfato inorgânico (Pi) – É um interveniente no processo glicolítico (intervém na reacção 6) pelo que faz sentido que a ter um papel regulatório, seja um papel estimulador.

Inibidores da hexocinase:

- Glucose-6-fosfato (músculo) – Faz sentido que funcione como inibidor, pois é o produto da reacção. Se temos muito produto, não vamos precisar de continuar a produzir mais…

- Frutose-6-fosfato (fígado) – É o produto da reacção seguinte (reacção 2), mas pode ser interpretado da mesma forma que o anterior. Ou seja, se estamos a acumular o intermediário formado a partir do produto da reacção, não adianta continuarmos a sintetizar mais produto. Esta inibição ocorre através de uma proteína denominada proteína reguladora da glucocinase.

Activadores da PFK-1:

- Frutose-2,6-bisfosfato (fígado) – Regulador alostérico mais significativo da PFK-1, reduzindo a sua afinidade para os inibidores ATP e citrato. É produzida em resposta à insulina e degradada em resposta ao glucagon.

- Frutose-6-fosfato –É o substrato, portanto faz sentido que se temos muito substrato a enzima seja activada.

- ADP e AMP – São produzidos quando se gasta ATP, ou seja, sinalizam um estado energético em baixa. Sendo assim, faz todo o sentido que activem a glicólise, de forma a que a célula possa repor os seus valores energéticos normais. Activam a enzima porque aliviam a inibição causada pelo ATP.

Inibidores da PFK-1:

- Glucagon (fígado) – Esta hormona é produzida numa situação de hipoglicemia e tem como objectivo elevar a concentração de glucose no sangue. Portanto, faz todo o sentido que iniba a glicólise, pois este processo gasta glucose, o que vai acentuar ainda mais a reduzida concentração sanguínea de glucose. Conforme referido anteriormente, o glucagon diminui os níveis de frutose-2,6-bisfosfato.

- ATP – O principal objectivo da glicólise é produzir energia (ATP). Portanto, se a célula já tiver ATP, faz todo o sentido que a glicólise seja inibida, impedindo assim um gasto desnecessário de um combustível metabólico tão precioso como a glucose! O ATP inibe a PFK-1 porque diminui a afinidade da enzima para o seu substrato, a frutose-6-fosfato.

- Citrato – Acentua o efeito inibitório do ATP. Esta molécula é o primeiro intermediário do passo seguinte do catabolismo aeróbico, o ciclo de Krebs. Portanto, se se estão a acumular intermediários do ciclo de Krebs, não adianta continuar a efectuar glicólise.

- Fosfoenolpiruvato – É um intermediário da glicólise formado na penúltima reacção. Ora, se está a acumular-se este intermediário, as reacções anteriores têm que ser inibidas, de forma a impedir uma acumulação ainda maior dessa molécula.

- H⁺ – Esta enzima é particularmente sensível a alterações de pH, funcionando como um “interruptor” que se desliga, por exemplo, quando efectuamos uma fermentação láctica (produz H⁺) exagerada, impedindo uma acumulação de H⁺ ainda maior.

Activadores da piruvato cinase:

- ADP – O motivo é o mesmo que já foi referido para a PFK-1, ou seja, é um indicador de um défice energético, pelo que vai levar a uma activação da glicólise.

- Frutose 1,6-bisfosfato – É um intermediário da glicólise formado numa reacção anterior à catalisada pela piruvato cinase. Sendo assim, se se estão a acumular intermediários numa fase anterior, temos que activar esta enzima, de forma a contrariar essa acumulação (é como quando uma barragem acumula muita água, e para repor os valores normais é necessário abrir a comporta…).

- Desfosforilação (fígado) – Induzida, por exemplo, pela insulina, o que faz todo o sentido, tendo em conta que a insulina é produzida numa situação de excesso de açúcar no sangue (hiperglicemia) e vai activar os processos (um deles é a glicólise!) que consumam glucose, de forma a baixar a concentração sanguínea de glucose.

Inibidores da piruvato cinase:

- ATP – É um transportador de energia química e um dos produtos finais da glicólise, logo, se existir já não é preciso efectuar a degradação da glucose. Diminui a afinidade da enzima para o fosfoenolpiruvato.

- Acetil-coA – É a molécula na qual o produto desta reacção (piruvato) é convertido, no caso do catabolismo aeróbico. Portanto, se se acumula acetil-CoA, não fazia sentido continuar a sintetizar piruvato, pelo que a enzima é inibida.

- Ácidos gordos de cadeia longa.

- Fosforilação (fígado) – Induzida, por exemplo, por acção do glucagon, que, conforme referi anteriormente, vai ter como principal função elevar os níveis de glucose no sangue. Para tal, inibe, por exemplo, a glicólise.

- NADH – Conforme iremos ver mais em detalhe quando eu falar da respiração celular, o NADH tem potencial para originar moléculas de ATP, pelo que sinaliza um estado energético em alta da célula. Nessa situação, não é preciso recorrer à glicólise para obter mais energia.

- Alanina – Este aminoácido (um dos 20 aminoácidos standard) pode originar piruvato (produto da reacção da piruvato cinase!) por remoção do seu grupo amina. Portanto, se existe uma molécula que pode originar directamente piruvato, não precisamos de estar a gastar glucose para o produzir.

Resumindo, é possível fazer algumas generalizações acerca da regulação das vias metabólicas, que irão ser úteis para perceber a regulação dos restantes processos.

Primeiro, moléculas energéticas, tais como o ATP, ou potencialmente energéticas, tais como o NADH são, de uma maneira geral, inibidores do catabolismo. Isto é muito fácil de perceber se pensarmos que o principal objectivo do catabolismo é produzir energia. Se a célula já tiver essa energia, não precisa de degradar mais nutrientes para produzir energia! O raciocínio oposto aplica-se ao ADP, AMP e NAD⁺, pois qualquer uma destas moléculas sinaliza um défice energético na célula (lembrem-se que quando gastamos ATP obtemos ADP ou AMP, e quando gastamos NADH obtemos NAD⁺…), pelo que será necessário repor os níveis energéticos, e para tal activa-se o catabolismo.

Segundo, o produto da reacção, ou intermediários formados a partir deste (produtos de reacções seguintes à reacção a considerar) são inibidores. Por outro lado, o substrato, ou intermediários que irão originar o substrato (formados em reacções anteriores à reacção que se está a considerar), são activadores.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Regulação do metabolismo

O nosso organismo apresenta uma flexibilidade metabólica notável! Basta pensar, por exemplo, que nós conseguimos adaptarmo-nos a situações tão contrárias como: estar 8-9 horas sem comer (quando dormimos, por exemplo), ou ingerir uma refeição muito calórica.

  

 

Ou então fazer um exercício físico muito intenso e num curto espaço de tempo, ou um exercício mais moderado e mais demorado, ou ainda ficar em repouso. Esta nossa capacidade de lidar correctamente com estes opostos é uma consequência da regulação que as nossas vias metabólicas sofrem.

 

 A regulação dos processos metabólicos é, na minha opinião o aspecto central para uma compreensão correcta do metabolismo.

Antes de começar a falar em concreto da regulação de cada via metabólica, convém abordar alguns conceitos mais gerais…

Em primeiro lugar, o que é a regulação das vias metabólicas? É o processo pelo qual a velocidade global de cada processo é alterada. Atenção, quando se fala em regulação não se está obrigatoriamente a falar de inibição, pois as vias metabólicas podem ser activadas ou inibidas.

Todas as vias metabólicas apresentam pelo menos uma reacção específica desse processo, que é irreversível. Isto garante à célula 2 aspectos muito importantes:

1. Faz com que as vias metabólicas não ocorram nos dois sentidos, como consequência apenas do fluxo de massas. Ou seja, se uma via metabólica produzir a molécula X e a célula precisar de produzir mais X, não vai ser pelo facto de já existir essa molécula dentro da célula que se vai dar a degradação da mesma.

2. Permite regular especificamente uma via metabólica sem ter que afectar outros processos, nomeadamente, o processo oposto. Para perceber isto podemos pensar em dois processos opostos, na glicólise (degradação de glucose) e na gluconeogénese (síntese de glucose), por exemplo. Nas células os dois processos não ocorrem simultaneamente, pois não fazia sentido estar a degradar e sintetizar glucose ao mesmo tempo. Portanto, quando um está activo, ou outro tem que estar inibido. Se ambos fossem catalisados pelas mesmas enzimas, era impossível activar um processo e inibir o outro. Ou se activavam os dois, ou se inibiam os dois… Como é que conseguimos dar a volta a este problema? Recorrendo pelo menos a uma enzima específica para cada processo! Assim, se eu tiver uma enzima específica na glicólise (na realidade são 3…) que não actua na gluconeogénese, eu posso activar ou inibir este processo sem afectar o oposto. J

São exactamente estas reacções específicas e irreversíveis que são catalisadas pelas chamadas enzimas regulatórias. As enzimas regulatórias são enzimas que funcionam como uma espécie de válvulas das vias metabólicas onde estão inseridas, permitindo “escoar” mais intermediários, se fizer falta mais produto, ou acumular esses intermediários, se existir produto suficiente. As reacções catalisadas por estas enzimas são muitas vezes designadas por pontos de regulação, sendo consideradas os passos limitantes (mais lentos) do processo do qual fazem parte. Sendo assim, se a sua velocidade for aumentada, a velocidade global da via onde estão inseridas aumenta, e se a sua velocidade for diminuída, a velocidade global do processo também diminui.

Há 4 tipos de regulação das vias metabólicas:

1. Disponibilidade do substrato – É o método de regulação mais rápido e afecta todas as enzimas de cada via metabólica. Basicamente, se existir pouco substrato, as enzimas não vão poder actuar à sua velocidade máxima, e se não existir substrato, as enzimas param.

2. Regulação alostérica – É a forma mais rápida de regulação específica de apenas determinadas enzimas, as chamadas enzimas regulatórias. Esta forma de regulação requer a presença de moléculas (moduladores alostéricos) que vão interactuar com as enzimas, levando a alterações estruturais que podem tornar a enzima mais rápida ou mais lenta (moduladores positivos e negativos, respectivamente).
3. Regulação hormonal – É um processo mais demorado do que a regulação alostérica, e envolve a produção de hormonas em resposta a um estímulo. As hormonas são lançadas na corrente sanguínea e vão actuar nas células-alvo. Normalmente a sua acção culmina na fosforilação ou desfosforilação das enzimas regulatórias, alterando a sua eficiência catalítica (activa ou inibe, dependendo da enzima em causa). Este efeito designa-se por modificação covalente reversível.
4. Alterações na concentração das enzimas – Esta é a forma mais lenta de regulação e pressupõe alterações nas taxas de síntese e degradação das enzimas, alterando a sua concentração. Por exemplo, se a célula pretender activar uma via metabólica, pode fazê-lo aumentando a quantidade das enzimas dessa via. Desde que o substrato não seja limitante, a velocidade global da conversão de substrato em produto vai aumentar. O efeito contrário verifica-se fazendo o raciocínio inverso.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Glicólise (enzimas da fase payoff)

A fase payoff, conforme já referi anteriormente, diz respeito ao conjunto das últimas 5 reacções da glicólise e permite à célula obter energia nesse processo. Cá vão algumas ideias sobre as 5 enzimas da fase payoff...

6ª Enzima - Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

Esta enzima, muitas vezes abreviada de GAPDH, apresenta-se sob a forma de um tetrâmero. Cada subunidade possui cerca de 35,9kDa (331 aminoácidos) e apresenta como cofactor uma molécula de NAD+. As subunidades são designadas por O, P, Q e R e são independentes umas das outras. Ou seja, cada subunidade catalisa a sua reacção sem a intervenção das restantes. Tal como descrito no post sobre as reacções da fase payoff, a reacção que esta enzima catalisa é dupla, envolvendo uma oxidação e uma adição de um grupo fosfato. É uma enzima que pode ser afectada pela presença de arsénio no nosso organismo, levando a que o rendimento da glicólise passe a ser nulo. O seu mecanismo de actuação envolve simultaneamente uma catálise covalente e ácido-base. Para tal, é indispensável a participação da cisteína 149 e da histidina 176 para os dois tipos de catálise, resectivamente. O substrato liga-se covalentemente à cisteína, formando um hemitioacetal. A nível laboratorial esta enzima é amplamente utilizada (eu também a utilizo...) como um controlo positivo em técnicas como immunoblotting ou RT-PCR, pois de uma maneira geral a sua expressão é constante em quase todos os tipos celulares. Por isso, é possível determinar alterações na expressão de determinado gene ou na presença de determinada proteína, comparando-a com os níveis de GAPDH.

7ª Enzima - Fosfoglicerato cinase

Esta enzima necessita de Mg2+ para efectuar a sua actividade catalítica. O nome da enzima deriva da reacção no sentido reverso, que ocorre durante a fixação fotossintética de CO2. É a responsável pela produção das primeiras moléculas de ATP na glicólise. A sua sequência de aminoácidos apresenta-se extremamente conservada em diferentes organismos. A enzima é monomérica, composta por dois domínios de tamanhos equivalentes, que corresponde às metades N- e C-terminal. O substrato (1,3-bisfosfoglicerato) liga-se à primeira metade, enquanto que o ADP se liga à segunda. Apresenta um mecanismo de cinética sequencial, em que a catálise de dá por efeitos de proximidade.

8ª Enzima - Fosfoglicerato mutase

A fosfoglicerato mutase é dimérica, sendo que cada uma das suas subunidades tem cerca de 32kDa. Conforme o nome indica, esta enzima é uma mutase, ou seja, catalisa a transferência de grupos fosforilo dentro de uma molécula. Por outras palavras, muda os grupos fosforilo de posição. Na realidade, a enzima encontra-se fosforilada (é uma fosfoenzima), e vai ceder o seu grupo fosforilo ao carbono 2 do substrato, originando um intermediário com 2 grupos fosforilo (2,3-bisfosfoglicerato). Só depois desse passo ocorrer é que o grupo fosforilo que se encontrava inicialmente no substrato (na posição 3) é removido, regenerando a forma inicial (fosforilada) da enzima.

A fosfoglicerato mutase possui 3 diferentes isoformas (isozimas, ou isoenzimas), sendo que uma delas é predominantemente encontrada no músculo cardíaco, outra no músculo esquelético e a terceira nos restantes tecidos.

9ª Enzima - Enolase

A enolase é uma metaloenzima dimérica, sendo que cada subunidade possui cerca de 40-50kDa. Essas subunidades apresentam uma orientação antiparalela, interactuando uma com a outra através de 2 pontes salinas, envolvendo uma arginina e um glutamato cada. O domínio N-terminal das subunidades possui 3 alfa-hélices e 4 folhas beta. O domínio C-terminal possui 2 folhas beta e 2 alfa-hélices, sendo que termina com um barril composto por folhas beta e alfa-hélices alternadas. Os 2 iões Mg2+ necessários para a actividade catalítica são fundamentais na neutralização de cargas negativas. Esta enzima apresenta um pH óptimo de cerca de 6,5, e pode ser também designada por fosfopiruvato desidratase. Foi incialmente descoberta em 1934, pelos investigadores Lohmann e Meyerhof. Tal como aconteceu com a enzima anterior, a enolase também possui 3 isoformas diferentes, sendo que uma é predominantemente encontrada no tecido muscular, outra nos neurónios e outra nas restantes partes do organismo.

A enolase é inibida pelo ião fluoreto, sendo que este facto é explorado, por exemplo, quando se fazem colheitas de sangue para análise. Nesse caso, quando é importante inibir a glicólise (para manter a concentração de glucose sanguínea inalterada), o sangue pode ser recolhido em tubos que contêm fluoreto.

10ª Enzima - Piruvato cinase

Esta enzima é responsável pela segunda produção de ATP na glicólise e é a terceira enzima regulatória dessa via metabólica. Necessita de 2 iões metálicos para funcionar: K+ e Mg2+ (ou Mn2+). Apresenta 4 diferentes isoformas, uma predominantemente localizada no fígado, outra nos glóbulos vermelhos, outra no músculo esquelético e cardíaco e cérebro e a última é essencialmente encontrada em tecidos fetais. É uma enzima tetramérica, sendo que cada subunidade apresenta cerca de 500 aminoácidos.

Principais fontes bibliográficas:

- Voet D, Voet JG, Biochemistry, Wiley

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers