Regulação do ciclo de Krebs

O ciclo de Krebs tem um papel central no nosso metabolismo. Em todas as aulas de metabolismo que eu dou, o ciclo de Krebs está presente...
Tal como já referi em posts anteriores, é composto por 8 passos, sendo que 3 deles são catalisados por enzimas regulatórias. Essas enzimas são a citrato sintase (1ª reação), isocitrato desidrogenase (3ª reação) e alfa-cetoglutarato desidrogenase (4ª reação).
Neste post vou falar um pouco sobre os principais ativadores e inibidores de cada uma delas. Conforme vão poder ver, existem muitos moduladores que são comuns a mais do que uma enzima, o que facilita a vida de quem tem que estudar esta via metabólica. :)

Citrato sintase:

Inibidores
Succinil-CoA - é um intermediário do ciclo de Krebs. Mais concretamente, é o 4ª intermediário do ciclo de Krebs, ou seja, é formado numa reação posterior à reação que estamos a considerar. Sendo assim, se temos uma acumulação de intermediários formados em reações posteriores, faz todo o sentido que esses possam inibir as primeiras reações da via metabólica em causa, neste caso a primeira.
Citrato - é o produto da reação, pelo que faz sentido que iniba a sua síntese.
ATP - o ciclo de Krebs é uma via catabólica, ou seja, tem como objetivo produzir energia (ATP). Se a célula já tiver energia, o processo é inibido.
NADH - o raciocínio é equivalente ao feito para o ATP. Ou seja, o NADH tem um potencial energético elevado, pois na respiração celular pode levar à produção de ATP, pelo que é lógico que funcione como um inibidor do ciclo de Krebs.
Ácidos gordos-CoA de cadeia longa - não está completamente esclarecido o papel inibitório dos ácidos gordos de cadeia longa no ciclo de Krebs, mas pensa-se que essa propriedade está relacionada com o facto de funcionarem como detergentes, pois são compostos anfipáticos, compostos por uma parte polar (grupo carboxílico) e uma parte apolar (cadeia hidrocarbonada). O ácido oleico (18 carbonos e uma ligação dupla no carbono 9) aparenta ser o principal ácido gordo inibidor da citrato sintase.

Ativadores
ADP - o ADP sinaliza um défice energético na célula, pois é produzido quando se gasta ATP para obtenção de energia. Sendo assim, faz todo o sentido que ative o ciclo de Krebs, pois o objetivo principal desta via metabólica é a produção de energia.

Isocitrato desidrogenase:

Inibidores
Succinil-CoA - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
ATP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
NADH - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.

Ativadores
ADP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
Ca2+ (músculo) - conforme já referi num post anterior, sobre a regulação do complexo piruvato desidrogenase, o Ca2+ é um mensageiro intracelular cuja concentração aumenta durante a contração muscular. Portanto, nesse contexto de contração as células vão precisar de energia, pelo que os processos catabólicos, e, em particular, o ciclo de Krebs, será ativado.

Alfa-cetoglutarato desidrogenase:

Inibidores
Succinil-CoA - é o produto da reação, pelo que faz sentido que iniba a sua síntese.
ATP - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.
NADH - o raciocínio que foi efetuado para a citrato sintase aplica-se nesta situação.

Ativadores
Ca2+ (músculo) - o raciocínio que foi efetuado para a isocitrato desidrogenase aplica-se nesta situação.

Ciclo de Krebs (enzimas) – parte 2

Após um final de ano letivo “atribulado” (como sempre…) e de um período de férias offline, estou de regresso aos posts. :)

Neste post vou continuar a descrever as principais características das enzimas do ciclo de Krebs…

Succinil-CoA sintetase

Esta enzima, também designada de sucinato tiocinase ou sucinato-CoA ligase, apresenta duas subunidades na sua constituição (alfa e beta). A subunidade alfa liga-se à molécula de CoA, enquanto que a subunidade beta se liga ao GDP. Existe uma isoforma desta enzima (também mitocondrial) cuja subunidade beta apresenta afinidade para o ADP, em vez do GTP.

O seu mecanismo de reação ocorre em três passos. A succinil-CoA sintetase apresenta um resíduo de histidina que desempenha um papel central na transferência do grupo fosfato para o nucleótido difosfato que se liga à subunidade beta.

Falhas na succinil-CoA sintetase estão na origem da doença “acidose lática infantil fatal”, que é uma doença caracterizada pela produção de níveis elevados de ácido lático (o que é facilmente explicável pelo facto do ciclo de Krebs ser um passo aeróbico do catabolismo dos hidratos de carbono), que normalmente originam a morte do indivíduo nos primeiros 4 dias de vida.

Succinato desidrogenase

Esta enzima, também designada de sucinato-coenzima Q redutase, pertence simultaneamente ao ciclo de Krebs e à cadeia respiratória mitocondrial, onde se designa por complexo II. Devido a isso, é a única enzima do ciclo de Krebs que está associada à membrana interna da mitocôndria (todas as restantes estão na matriz…). Utiliza como cofator o FAD.

Estruturalmente, apresenta quatro subunidades, duas hidrofílicas e duas hidrofóbicas. As duas primeiras são uma flavoproteína (SdhA) e uma proteína de ferro-enxofre (SdhB). É na subunidade SdhA que se liga covalentemente o FAD e o sucinato, enquanto a SdhB é caracterizada por apresentar 3 centros de ferro enxofre ([2Fe-2S], [4Fe-4S] e [3Fe-4S]). As subunidades hidrofóbicas (SdhC e SdhD) funcionam como âncoras membranares. Estas duas subunidades formam o citocromo b, caracterizado por apresentar 6 domínios transmembranares, um grupo heme e um local de ligação à ubiquinona (que envolve também a subunidade SdhB).

O local de ligação ao sucinato (subunidade A) envolve as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos importantes, nomeadamente, a Treonina254, Histidina354 e a Arginina399.

O local de ligação à ubiquinona requer a presença de alguns resíduos de aminoácidos indispensáveis para a sua função, nomeadamente, a Prolina160, Triptofano 163, Triptofano 164, Histidina207 e Isoleucina209 (subunidade B), Serina27, Isoleucina28 e Arginina31 (subunidade C) e a Tirosina83 (subunidade D).

Falhas na sucinato desidrogenase podem levar ao aparecimento de diversas patologias, nomeadamente:

- Síndrome de Leigh, encefalopatia mitocondrial e atrofia ótica (mutações na SdhA).

- Paraganglioma hereditário, feocromocitoma hereditário e produção excessiva de iões superóxido (mutações na SdhB, SdhC e/ou SdhD).

Fumarase

Esta enzima, também designada de fumarato hidratase ou malato hidroliase, apresenta duas isoformas, uma mitocondrial e outra citosólica. É uma enzima tetramérica, sendo que o local de ligação ao substrato é designado por centro catalítico A e envolve aminoácidos de 3 das 4 subunidades.

A enzima apresenta-se em duas formas distintas, E1 e E2. A primeira é caracterizada pela presença de 2 grupos ácido/base (indispensáveis para a sua atividade catalítica) sem carga, sendo responsável pela ligação ao fumarato e posterior transformação química em malato. A forma E2 apresenta os dois grupos ionizados sob a forma de zwitterião (um com carga positiva e outro com carga negativa), sendo caracterizado pela ligação ao malato. As duas formas interconvertem-se durante o ciclo catalítico da enzima.

Deficiência na fumarase é designada por polihidramnios, estando também associada ao aparecimento de leiofibromiomas na pele e no útero e carcinoma renal.

Malato desidrogenase

A malato desidrogenase possui duas isoformas distintas, uma mitocondrial (isoforma 2) e outra citosólica (isoforma 1). É uma enzima que além de fazer parte do ciclo de Krebs, está igualmente envolvida na gluconeogénese.

Estruturalmente, possui semelhanças com a lactato desidrogenase, apresentando uma estrutura homodimérica (subunidades com massas de 30-35 kDa). Cada subunidade apresenta dois domínios, sendo que o primeiro é caracterizado por uma estrutura em folha-beta, enquanto o outro apresenta o local de ligação ao NAD+, composto por 4 folhas-beta e uma hélice alfa. As subunidades interatuam entre si através de ligações de hidrogénio e interações hidrofóbicas.

O centro ativo da enzima é essencialmente hidrofóbico, com locais de ligação distintos para o malato e para o NAD+. Apresenta alguns resíduos de aminoácidos particularmente importantes para a sua atividade catalítica, nomeadamente, a Arginina102, a Arginina109, o Aspartato168, a Arginina171 e a Histidina195.

Ciclo de Krebs (enzimas) - parte 1

O ciclo de Krebs é uma via metabólica composta por 8 reações bioquímicas, cada uma catalisada por uma enzima diferente. Aqui ficam algumas informações sobre as primeiras quatro enzimas do ciclo de Krebs…

Citrato sintase

A citrato sintase é uma enzima amplamente utilizada como um biomarcador enzimático da presença de mitocôndrias intactas, seja em culturas celulares ou em preparações organelares. Apesar de ser uma enzima mitocondrial, é codificada pelo DNA nuclear e sintetizada no citosol.

Esta enzima é a primeira enzima regulatória do ciclo de Krebs. Utiliza dois substratos diferentes, o oxaloacetato e a acetil-CoA. O oxaloacetato liga-se primeiramente à enzima, o que induz alterações conformacionais que criam o local de ligação para a acetil-CoA. 

Do ponto de vista estrutural, é composta por 437 resíduos de aminoácidos e apresenta duas subunidades, cada uma com cerca de 20 hélices alfa. O centro ativo apresenta 3 resíduos de aminoácidos indispensáveis para a função catalítica da enzima, pois estabelecem interações específicas com os substratos – His274, His320 e Asp-375.

O seu mecanismo de ação envolve uma condensação aldólica. Para uma visão em vídeo do mecanismo de ação da citrato sintase, clique aqui. 

Aconitase

A aconitase é uma enzima que apresenta um centro de ferro-enxofre funcional [Fe₄S₄]²⁺, que interatua com 3 resíduos de cisteína da enzima. É particularmente sensível ao stress oxidativo e, em especial, ao anião superóxido, devido ao centro de ferro-enxofre.

Apresenta dois homólogos no nosso organismo, nomeadamente, a iron-responsive element-binding protein (IRE-BP) e a 2-isopropilmalato desidratase (ou alfa-isopropilmalato isomerase).

Do ponto de vista estrutural, a aconitase apresenta duas conformações, uma para o estado inativo e outra para o estado ativo. Na forma inativa, possui quatro domínios, sendo que os primeiros três estabelecem interações com o centro de ferro-enxofre, enquanto o último possui o centro ativo. Quando se torna ativa, a enzima sofre alterações no centro de ferro enxofre (passa de Fe₃S₄ para Fe₄S₄), sendo esta a principal diferença entre as duas conformações da enzima.

O seu mecanismo de ação recorre a um mecanismo de desidratação-hidratação, através do intermediário cis-aconitato.

O seu centro ativo possui dois resíduos de aminoácidos particularmente importantes para a atividade catalítica – His101 e Ser642.

A importância desta enzima do ponto de vista fisiológico é suportada pela existência de várias doenças que a afetam. Uma delas é designada por deficiência em aconitase. É provocada por uma mutação no gene que codifica uma proteína responsável pela montagem do centro de ferro-enxofre. Esta doença causa miopatia e intolerância ao exercício, pois o catabolismo aeróbico destes indivíduos está comprometido. Outra doença é a ataxia de Friedreich (FRDA), caraterizada por uma menor atividade da aconitase e de outra enzima do ciclo de Krebs. A sucinato desidrogenase. Além destas, há estudos que apontam para uma possível relação entre a aconitase e a diabetes. Contudo, trata-se ainda de uma hipótese que tem que ser melhor caracterizada.

Isocitrato desidrogenase

A isocitrato desidrogenase é a segunda enzima regulatória do ciclo de Krebs. Há três isoformas diferentes da isocitrato desidrogenase. Uma existe apenas na matriz mitocondrial e utiliza o NAD⁺ como aceitador de eletrões. As outras isoformas utilizam o NADP⁺ como aceitador de eletrões e aparentam ter como principal função a formação de NADPH, essencial para as reações anabólicas redutoras. Estas formas estão presentes na matriz mitocondrial, no citosol e no peroxissoma.

As formas que utilizam NADP⁺ como cofator possuem uma estrutura homodimérica, enquanto as que utilizam NAD⁺ é um heterotetrâmero.

A reação catalisada pela isocitrato desidrogenase envolve a formação de um intermediário, o oxalossuccinato.

Do ponto de vista clínico, foram encontradas algumas mutações na isocitrato desidrogenase em alguns tumores cerebrais, nomeadamente, astrocitoma, oligodendroglioma e glioblastoma multiforme. Também há alguns estudos que apontam para uma possível relação entre mutações na enzima e a leucemia mieloide aguda.

Alfa-cetoglutarato desidrogenase

Este é o terceiro (e último!) ponto de regulação do ciclo de Krebs.

Esta enzima, que também pode ser designada por oxoglutarato desidrogenase, é, na realidade um complexo multienzimático. É formado pelas seguintes enzimas: alfa-cetoglutarato desidrogenase, dihidrolipoil succiniltransferase e dihidrolipoil desidrogenase. Apresenta uma composição e um mecanismo de reação muito semelhante ao complexo piruvato desidrogenase. Devido a isso, pensa-se que possivelmente ambos os complexos tiveram uma origem comum e a certa altura do percurso evolutivo sofreram evolução divergente.

Clinicamente, este complexo enzimático funciona como um autoantigénio na cirrose biliar primária, uma forma aguda de falha hepática. Além disso, a sua atividade catalítica também se encontra diminuída em várias doenças neurodegenerativas.

Ciclo de Krebs (reações) - parte 2

Passo 5: conversão de succinil-CoA em succinato

Esta reacção requer Mg²⁺. A enzima que catalisa esta reação, succinil-CoA sintetase, quebra a ligação tioéster (S-CoA), libertando uma grande quantidade de energia que é utilizada para fosforilar o GDP em GTP. É mais um exemplo de um acoplamente energético.

Passo 6: oxidação de succinato a fumarato

O succinato é oxidado a fumarato, levando à produção de FADH₂ a partir de FAD. A reação é catalisada pela succinato desidrogenase que é a única enzima do ciclo de Krebs que não está na matriz, mas sim fortemente associada à membrana interna da mitocôndria.

Passo 7: Hidratação de fumarato a malato

Esta enzima é altamente estéreo-específica, produzindo apenas o esteroisómero L-malato. A reação é reversível nas condições celulares.

Passo 8: oxidação do malato a oxaloacetato

Esta reacção produz uma molécula de NADH a partir de NAD⁺. Em condições intracelulares a reacção está bastante deslocada no sentido inverso, mas como o oxaloacetato é continuamente removido (pela reacção de síntese de citrato, pela gluconeogénese ou por transaminação para originar aspartato), o equilíbrio é deslocado no sentido directo. O oxaloacetato utilizado na primeira reação do ciclo de Krebs é então regenerado, pelo que teoricamente uma molécula de oxaloacetato pode estar envolvida na oxidação de um número infinito de moléculas de acetil-CoA (tem um papel “catalítico”) e, por isso, o oxaloacetato está presente nas células em concentrações muito baixas.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Ciclo de Krebs (reações) - parte 1

Passo 1: fomação de citrato

Esta reacção irreversível é o 1º ponto de regulação do ciclo de Krebs. É uma reação em que o oxaloacetato se condensa com a acetil-CoA. Nesse processo forma-se um intermediário bastante energético (citroil-CoA) que rapidamente se converte em citrato. A molécula de CoA-SH libertada é reciclada para participar numa nova descarboxilação oxidativa do piruvato (catalisada pelo complexo piruvato desidrogenase).

Passo 2: formação de isocitrato via cis-aconitato

Esta reacção ocorre através da formação de um intermediário, o cis-aconitato, que se obtém por desidratação do citrato. Seguidamente, o cis-aconitato é hidratado formando-se isocitrato. Portanto, o citrato e o isocitrato são isómeros. Apesar desta reacção em condições celulares estar deslocada no sentido de produzir apenas cerca de 10% de isocitrato, o rápido consumo deste produto de reacção desloca a reacção no sentido directo. O fluoroacetato é uma molécula tóxica porque em condições fisiológicas converte-se em fluoroacetil-CoA, que se condensa com o oxaloacetato para formar fluorocitrato, o que inibe a aconitase, causando acumulação de citrato.

Passo 3: oxidação de isocitrato a α-cetoglutarato e CO2

Esta reação é um exemplo de uma descarboxilação oxidativa irreversível, sendo o 2º ponto de regulação do ciclo de Krebs. Na realidade, esta reação é um conjunto de 3 reações diferentes:

1. Desidrogenação do isocitrato, originando oxalosuccinato e produzindo-se NADH.

2. Ligação do Mn²⁺ ao grupo carbonilo do oxalosuccinato, estabilizando o enol e promovendo a libertação de CO₂.

3. Hidrogenação, com arranjo do híbrido de ressonância.

Passo 4: oxidação de α-cetoglutarato a succinil-CoA e CO2

Esta reação, tal como a anterior, é outro exemplo de uma descarboxilação oxidativa irreversível. É o 3º (e último!) ponto de regulação do ciclo de Krebs. Esta reacção é virtualmente idêntica à descarboxilação oxidativa do piruvato, levando também à formação de NADH. É uma reação muito exergónica devido à energia armazenada na ligação S-CoA.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Ciclo de Krebs (generalidades) - parte 2

Por cada ciclo de Krebs efectuado, são produzidas 3 moléculas de NADH, 1 de FADH2 e 1 de ATP(GTP).

A passagem dos electrões de uma molécula de NADH para o O2 na fosforilação oxidativa leva à formação de 2,5 moléculas de ATP. Se o dador de electrões for o FADH2, são formadas 1,5 moléculas de ATP. Portanto, uma molécula de glucose, completamente oxidada a CO2, via glicólise, piruvato desidrogenase, ciclo de Krebs e fosforilação oxidativa, origina 32 moléculas de ATP.

O ciclo de Krebs desempenha um papel central no metabolismo celular, pois todos os nutrientes que podem ter um papel “energético” geram no seu catabolismo acetil-CoA.  

Além de oxidar acetil-CoA a CO2 e produzir ATP, NADH e FADH2, também recebe vários intermediários resultantes de várias vias catabólicas. Oxaloacetato e α-cetoglutarato, por exemplo, são os produtos da decomposição de aspartato e glutamato. Além de receber intermediários de vários processos catabólicos, fornece também vários intermediários para processos anabólicos. Devido a esta característica (servir vias catabólicas e anabólicas) o ciclo de Krebs é um processo anfibólico.

Oxaloacetato e α-cetoglutarato são também percursores de aminoácidos e das bases púricas e pirimídicas. Oxaloacetato é convertido em glucose na gluconeogénese, succinil-CoA é intermediário na síntese do anel porfirínico dos grupos heme.

Quando os intermediários do ciclo de Krebs são desviados para processos biossintéticos, a sua quantidade é reposta por reacções anapleróticas. A reacção anaplerótica mais importante no fígado e nos rins é a carboxilação reversível do piruvato para originar oxaloacetato. A enzima que catalisa esta reacção é a piruvato carboxilase e é estimulada por acetil-CoA. Outra reacção anaplerótica importante é a carboxilação do fosfoenolpiruvato originando oxaloacetato. A enzima que catalisa esta reacção é a fosfoenolpiruvato e é estimulada por frutose-1,6-bisfosfato. Outras reacções anapleróticas importantes são as transaminações, de forma a obter aminoácidos (os intermediários do ciclo fornecem o esqueleto de carbonos). O ciclo também fornece intermediários para a síntese de glucose (gluconeogénese) e de ácidos gordos.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Ciclo de Krebs (generalidades) - parte 1

O ciclo de Krebs é também designado por ciclo do ácido cítrico ou dos ácidos tricarboxílicos. É um processo catabólico que ocorre na mitocôndria, mais concretamente, na matriz mitocondrial (conforme irei destacar num próximo post, apenas uma reacção se dá em associação com a membrana interna da mitocôndria). Neste ciclo a célula oxida moléculas de acetil-CoA a CO2, sendo a energia libertada conservada sob a forma de NADH e FADH2. O ciclo de Krebs é unicamente aeróbio, pois apesar de o O2 não participar directamente no ciclo, o NAD+ e o FAD só podem ser regenerados na mitocôndria através da transferência de electrões para o O2 (no post relativo à regulação do ciclo de Krebs, que irei colocar em breve, vai ser possível ver que se se acumula NADH, que é o que acontece na ausência de O2, o ciclo de Krebs é inibido...).

No ciclo de Krebs oxidamos vários moles de acetil-CoA por dia. Os oxidantes são o NAD+ e o FAD que se reduzem a NADH e FADH2. Na célula só existem algumas micromoles de NAD+ e FAD e dentro da mitocôndria (onde o ciclo ocorre) a regeneração do NAD+ e do FAD depende da cadeia respiratória, pelo que em condições anaeróbias não existe ciclo de Krebs. O ciclo de Krebs é como que um “moinho” em que o “grão” (o substrato) é o grupo acetilo do acetil-CoA e a “farinha” (os produtos) são o CO2 e os electrões (NADH e FADH2); a “mó do moinho” são as enzimas e os compostos intermediários.

Principais fontes bibliográficas:

- Quintas A, Freire AP, Halpern MJ, Bioquímica - Organização Molecular da Vida, Lidel

- Nelson DL, Cox MM, Lehninger - Principles of Biochemistry, WH Freeman Publishers

Ciclo de Krebs (principais aspectos)

Ciclo de Krebs

- Tipo de via metabólica: catabólica cíclica

- Objectivo: obtenção de energia a partir da oxidação de acetil-CoA

- Localização subcelular: matriz mitocondrial

- Condições em que ocorre: aerobiose

- Nº de reacções bioquímicas: 8

- Rendimento energético (por molécula de acetil-CoA): +3 NADH,  1 FADH2 e +1 GTP

- Produto final (por molécula de acetil-CoA): 2 CO₂